植物生理学实验叶绿体色素含量的测定 ----分光光度法 摘要: 叶绿体色素溶液各组成成分在可见光谱中具有不同的特征吸收峰。因此乙醇含量，应用分光光度 计在某一特定波长下所测定的吸光度。叶绿体色素的提取常用丙酮和乙醇有机溶剂。叶绿体 色素 95 ％乙醇提取液中叶绿素 及类胡萝卜素分别在665nm 470nm波长下具有最大吸收峰汽油检测仪，据此所测得的吸光度值代人不同的经验公式（见结果计算），计算 出叶绿体色素乙醇提取液中叶绿素 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的总浓度，并依据所使用的单位植物组织（鲜重、干重或面积）甲醇检测仪，求算出色素的含量。 实验原理与实验目的实验原理： 利用95%乙醇提取叶绿体色素，叶绿素a、叶绿素 和类胡萝卜素最大吸收峰的波长分别是665nm、649nm和470nm。 根据分光光度计测定的吸光度值，可以计算出乙醇提取液中叶绿体色素含量。 实验目的： 掌握分光光度法对叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总浓度和类胡萝卜素总浓度测定和计算的 方法。 实验材料和方法植物材料：菠菜叶片、番茄幼苗叶片 实验用具：分光光度计、天平、研钵、漏斗、剪刀、容量瓶、烧杯、滤纸、滴管等 实验试剂：95%乙醇、石英砂和碳酸钙 试验方法：分光光度法 叶绿体色素的提取取新鲜菠菜叶片（或番茄幼苗叶片）0.5 克,擦干,去中脉,剪碎放入研钵;加入少许石英砂 和CaCO ,再加入95%乙醇3ml,研磨成匀浆,再加95%乙醇10ml,静置10分钟;用漏斗滤去残 渣,用丙酮反复冲洗研钵、残渣至无色;用容量瓶定容至50ml 2、吸光度的测定取光径1cm 比色杯，注入上述叶绿素提取液,以95%乙醇注入另一同样的比色杯内作为 空白对照,在波长665、649 和470nm 下测定吸光度。

3、结果计算 依据下列丙酮提取液中色素浓度计算公式,分别计算出叶绿素a、b 的浓度及其叶绿素总 浓度和类胡萝卜素的浓度。 附录：722 分光光度计的使用 1、选择灵敏度旋纽至3；将波长调节到600nm，打开样品室盖，打开电源开关预热20min。 2、打开样品室盖，将测定旋纽调至T（透光度），用调节旋纽0 调0；盖上样品室盖，用调 节旋纽100 调100。 3、将空白样品放入样品槽，按上述方法调0 和调100。 4、将测定旋纽调至A（吸光度），用Abs 旋纽调0，测定待测样品的光密度。 计算公式： 95%乙醇提取液中色素浓度的计算 （叶绿素a）=13.95A665 6.8A649 （叶绿素b）=24.96A649 7.32A665 =18.16A649 6.63A665 x.c（类胡萝卜素）=(1000A 470 )/248叶绿体色素含量= 实验结果与讨论1、菠菜叶片不同波长下的吸光度(0.42g) 波长（nm） 吸光度 平均值 665 0.702 0.683 0.755 0.7133 649 0.328 0.326 0.340 0.3313 470 0.823 0.827 0.861 0.8370 （叶绿素a）=13.95*0.7133–6.8*0.3313=7.6977mg/L （叶绿素b）=24.96*0.3313–7.32*0.7133=3.0479mg/L =18.16*0.3313+6.63*0.7133=10.7456mg/L x.c（类胡萝卜素）=(1000A 470 样品鲜重（或干重、面稀释倍数 （叶绿素b）含量=3.0479mg/L*0.05L*1/0.42g=36.28mg/g x.c（类胡萝卜素）含量=1.8995mg/L*0.05L*1/0.42g=22.61mg/g 2、1#番茄幼苗叶片不同波长下的吸光度(0.34g) 波长（nm） 吸光度 平均值 665 0.463 0.452 0.453 0.4560 649 0.203 0.264 0.275 0.2473 470 0.492 0.464 0.479 0.4783 （叶绿素a）=13.95*0.4560–6.8*0.2473=4.6796mg/L （叶绿素b）=24.96*0.2473–7.32*0.4560=2.8347mg/L =18.16*0.2473+6.63*0.4560=7.5142mg/L x.c（类胡萝卜素）=(1000 x.c（类胡萝卜素）含量=0.5778mg/L*0.05L*1/0.34g=8.50mg/g 3、4#番茄幼苗叶片不同波长下的吸光度(0.2g) 波长（nm） 吸光度 平均值 665 0.219 0.225 0.231 0.2250 649 0.113 0.117 0.124 0.1180 470 0.253 0.259 0.268 0.2600 （叶绿素a）=13.95*0.2250–6.8*0.1180=2.33636mg/L （叶绿素b）=24.96*0.1180–7.32*0.2250=1.29828mg/L =18.16*0.1180+6.63*0.2250=3.6353mg/L x.c（类胡萝卜素）=(1000* （叶绿素b）含量=1.29828mg/L*0.05L*1/0.2g=32.457mg/g x.c（类胡萝卜素）含量=0.43mg/L*0.05L*1/0.2g=10.75mg/g 讨论： 叶绿素a、b 在蓝色区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素的定量分析？为 什么？ 答：不能。定量分析的吸收峰必须要稳定，还要有强的吸收；另外乙醇含量，还需要考虑干扰 的问题。光合色素除了叶绿素外还有类胡萝卜素，类胡萝卜素主要吸收蓝光乙醇含量，为了排 除干扰要选用红光。 参考文献： 王英典，刘

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